革兰氏染色的关键步骤是什么

革兰氏染色的关键步骤是什么

酒精脱色为整个流程最关键的一步。

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。

革兰氏染色法，是指细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法，属于复染法。这种染色法是由丹麦医生革兰于1884年所发明，最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷伯肺炎菌。革兰染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难区别。经染色后，阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，从而用以分类鉴定。染色原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细菌细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，再用95%乙醇脱色。

革兰氏染色原理是什么

革兰氏染色法的原理是通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙。

因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差。

在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

革兰氏染色的注意事项

注意事项

１、选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。

２、涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。

３、脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。

实验流程

１、取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用马克笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。

２、涂片

液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近５厘米左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径２毫米左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。

固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。

３、晾干：让涂片在空气中自然干燥。

４、固定：让菌膜朝上，通过火焰２－３次固定（以不烫手为宜）。

５、染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染１分钟。

６、水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。

７、媒染：滴加１滴碘液，染１分钟，水洗。

８、脱色：吸去残留水，连续滴加９５％乙醇脱色２０－３０秒至流出液无紫色，立即水洗。

９、复染：滴加蕃红复染３－５分钟，水洗。至此，革兰氏染色结束。

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